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用超聲波破碎儀破碎大腸桿菌注意事項
用
超聲波
破碎
儀破碎
大腸桿菌注意事項
用
大腸桿菌表達外源蛋白,在進行
超聲
波
破碎
之前
,用含有1%triton-X-100的PBS懸浮,效果較好,1%triton-X-100的作用還是很明顯的,對其他的一些**同樣起作用,比如鏈霉菌。
**沉淀直接加樣品1 buffer,再加5μl的巰基乙醇,混勻,離心,煮沸10min,直接上樣,染色脫色步驟如下:將膠放入適量的染色液微波爐里加熱1min(下次適當補點醋酸即可),將染色液換成大量的水(自來水即可)在微波爐煮10min 就可以。在表達重組蛋白后超聲波破碎細胞,采用冰浴,400w,破2s停1s,但是不一會就產(chǎn)生大量泡沫,影響了破碎功率, pbs和tris緩沖液都是這樣,*后都是破碎不完全,而我的目的蛋白就在這些未破碎的細胞中。
1*
會產(chǎn)生氣泡是因為你的探頭位置沒放好。
超聲波
破碎
儀
探頭一定要接近底部,約1cm(推薦是距底部0.5mm)。功率根據(jù)儀器不同會有所不同,但你可以觀察液面,有波動但不要太劇烈就好。
2*
破3s停10s,破碎20-30個循環(huán)觀察效果。
3*
探頭位置擺放也要注意,聽聲音如果不對的話就要及時調(diào)整。另外可以從菌濃度方面考慮。在
超聲波
破碎時試著加大體積,振幅*好不要超過60%.
4*
嘗試超8s停8s,對有些菌體蛋白來說,通常方法很難散熱,導(dǎo)致蛋白變性產(chǎn)生氣泡,*好停頓時間稍長一些,這種情況多見于包涵體形式的蛋白。如果換用
Branson
超聲波破碎儀
來進行工作,由于熱耗較小,停頓周期可適當減小。
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細胞破碎的方式
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